一、检测原理 本试剂盒采用间接竞争elisa 方法，样品中游离的黄 曲霉毒素m1 与酶标板上固相包被的黄曲霉毒素m1 抗原 竞争结合特异性抗体，酶标二抗可与抗体反应，再通过酶 的专一性显色剂显色，因为酶可以使无色的显色剂转变成 蓝色，终止液的加入可以终止显色，蓝色转变成黄色，吸 收值可以在450nm 处进行测定。颜色变化的程度反映样品 中黄曲霉毒素m1 的含量。 二、检测范围 本试剂盒是应用elisa 技术研发的药物残留检测产品, 与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出液态奶、奶 粉、酸奶、奶酪等样本中的黄曲霉毒素m1。 三、交叉反应率 黄曲霉毒素m1………………………………… 四、试剂盒组成 酶标板1 块，96 孔/板 标准液6 瓶（1ml/瓶）： 0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb 抗体工作液……………………………………………5ml 酶标记物……………………………………………10ml 底物液a ……………………………………………7ml 底物液b ……………………………………………7ml 终止液…………………… ..……… ………… .. .…7ml 10× 浓缩酸奶样品稀释液………………………5ml 10× 浓缩洗涤液………………….…...…………40ml 2× 浓缩样品稀释液………………. ..…………50ml 说明书…… … … … … … … . . … … … . .… … … 1 份 五、使用单位需自备的设备及试剂 （1）仪器 微孔板酶标仪(450 nm/630 nm) 振荡器；离心机；涡旋仪； 电子天平（感量0.01 g） （2）器材 单道微量移液器：20 μl～200 μl，100 μl~1000 μl 多道微量移液器：30 μl～300 μl （3）试剂 去离子水 五、溶液的配制 配液1: 样品稀释液 用去离子水将浓缩样品稀释液按1：1 体积比进行稀释， 即1 份浓缩样品稀释液加1 份去离子水。 配液2: 洗涤工作液 用去离子水将浓缩洗涤液按1：9 体积比进行稀释，即 1 份浓缩洗涤液加9 份去离子水，用于酶标板的洗涤， 洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。 配液3: 酸奶样品稀释液：将浓缩酸奶样品稀释液用去离子 水按1:9 体积比进行稀释（1 份浓缩酸奶样品稀释液 +9 份去离子水）。 配液4：样品提取液：将和浓缩样品稀释液按1:3 体积 比例进行混匀（1 份+3 份浓缩样品稀释液）。 六、样本前处理方法 样本处理前须知： （1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要 更换吸头。 （2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁 净实验器具，以避免污染干扰实验结果。 样本前处理步骤： （一）液态奶（含生鲜奶及成品液态奶） 1、取待测样品，3000rmp 室温下离心10min（除去脂肪层）； 2、下层500μl 待测样本，加入500μl 样品稀释液混匀2min； 3、取下层50μl 用于分析。 稀释倍数：2 （二）酸奶 1、称取0.5g 待测样品，加入500μl 酸奶样品稀释液，混 匀2min； 2、7000rmp 室温下离心10min 3、取下层50 μl 用于分析。 稀释倍数：2 （三）奶粉 1、称取1 g 样品，加入6ml ，混匀2min； 2、3000rpm 室温下离心，10min；取上清3ml，50℃氮吹； 3、加入0.5ml 浓缩样品稀释液复溶，再加入0.5ml 正 混匀2min，3000rpm 室温下离心，5min； 4、取下层50μl 用于分析。 稀释倍数：1 （二）奶酪 1、取1g 研磨后的奶酪，加入6ml ，7000rpm 室温下 离心，5min； 2、取下层2ml，60℃氮吹； 3、加入1ml ，再加入2ml 样品提取液，混匀2min； 4、5000rpm 室温下离心，5min； 5、取下层50 μl 用于分析。 稀释倍数：6 七、酶联免疫检测步骤 测定前须知： 1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。 2、使用之后立即将所有试剂放回2~8 ℃。 3、在使用中不要让微孔干燥。 4、在elisa 分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一 致性，正确的洗板操作是elisa 测定程序中的要点。 5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住 微孔板。 测定步骤： 1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡 30 min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2 个平行试验。 2、加标准品：加入标准品/样品50 μl/孔，再加抗体工作液 50 μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖好，室温25 ℃下 避光反应15 min。 3、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液300 μl/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗涤4~5 次，用吸水纸 拍干。 4、加结合物：加入酶标记物100 ??l/孔，轻轻振荡混匀，用 盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min，取出重复 洗板步骤3。 5、显色：每孔先各加入底物液a 50 μl，再各加入底物液b 50 μl，轻轻振荡混匀，并在室温25℃下避光反应10~15 min。 6、测定：每孔各加50 μl 终止液，设定酶标仪在450 nm 处， 测定od 值（建议用450/630 nm 双波长检测，在5 min 内读完数据）。 八、结果分析 所测得的标准液或样品吸光度的平均值（b）除以 个标准液（0 标准液）的吸光度（b0）值再乘以， 得到百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ b b 0 ?? 以标准品浓度的10 为底的对数为x 轴， 百分吸光 值为y 轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标 准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10 的 幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含黄曲霉毒素m1 的量。 利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品 的准确、快速分析。 九、试剂盒灵敏度、准确度、精密度 灵敏度：0.05 ppb 检测限： 液态奶…………………………………0.1ppb 酸奶……………………………………0.1pb 奶粉…………………………………0.25ppb 奶酪…………………………………0.3pb 回收率：80±15% 精密度：试剂盒的变异系数均小于10% 十、注意事项 1、室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20~ 25 ℃）会导致所有标准的od 值偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标 准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干 后应立即进行下一步操作。 3、反应终止液为2m 酸，避免接触皮肤；若不慎滴漏 到皮肤上，请尽快用水冲洗。 4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有 效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的 试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号 试剂盒中的试剂。 5、保存试剂盒于2~8 ℃，不要冷冻，将不用的微孔板放 进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏 感，因此要避免直接暴露在光线下。 6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之；0 标准的吸光度（450 nm）值小于0.5（a450nm< 0.5）时， 表示试剂可能变质。 7、在加入底物液后，一般显色15 min 即可。若颜色较 浅，可延长反应时间到20 min（或更长），但不得超 过30 min；反之，则减短反应时间。 8、该试剂盒反应温度为25 ℃是特好的，温度过高或过低将 导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。 十一、贮藏条件及保存期 贮藏条件：在2~8 ℃保存试剂盒。 保存期：本试剂盒有效期为12 个月。